粪便代谢组是研究肠道菌群最重要的组学方法之一。然而，由于代谢物检测技术的局限性，数据往往不能反映肠道菌群代谢组的全貌，存在大量无法被鉴定的未知分子，且不同研究间的数据难以横向比较，重复性较差。那么，这一系列问题应该如何解决呢？

今天，我们特别编译了发表在The Scientist杂志上的文章，该文章讨论了粪便代谢组重复性不佳的问题。希望本文能够为相关的产业人士和诸位读者带来一些启发和帮助。

“我们不仅仅是人”，加利福尼亚大学戴维斯分校的代谢组学研究员Oliver Fiehn认为，人体的奥秘远甚于目之所及。他说：“我们是一个生态系统。”

这个生态系统容纳了数以万亿计的细菌和真菌，它们生活在人体内部和表面，构成了人类微生物组。这些微小的生物一直在与我们并肩作战、谋求共存，消耗和分泌着影响人体细胞的分子。在我们的消化系统中，微生物数量最庞大，它们会影响诸多疾病，如克罗恩病、焦虑症、心血管疾病和癌症等。

人的肠道如迷宫一般，研究者可以窥探这座迷宫，探寻其中的微生物。不过，只要研究者内心足够强大，还有一种更简单的方法，那就是研究粪便。粪便中含有肠道微生物分泌的化学成分，同时也蕴藏着微生物碎片。科学家可以像考古学家一样，挖掘粪便样本，寻找有关肠道菌群的线索。

过去十年，科学家们解析了肠道菌群这种复杂的生态系统，研究成果颠覆了人们对健康的传统认知。人们意识到，关乎人体健康的不止是自身的细胞和器官，靶向微生物的新型诊疗方法也具有改善人类健康的潜力。然而，并不是所有的新想法都能够经得住考验。

一个广为人知的例子是，2020年有科学家宣布可通过人体组织和血液的微生物组诊断健康人是否罹患癌症¹。但去年另一组科学家声称，2020年的研究不但无法重复，且存在问题²。虽然这一案例尚无定论，但缺乏可重复性已成为肠道微生物组领域的一个普遍问题。为了规避不靠谱的研究结果，科学家呼吁人们制定一些标准。阿尔伯塔大学的生物化学家David Wishart说：“这对于推动领域发展至关重要，有助于人们找到治疗慢性疾病的终极方法。”

制定标准，正是美国国家标准与技术研究院（NIST）的职责所在。现在，他们迎来了全新的挑战。NIST微生物组组长Scott Jackson说，他们正在全面解析粪便，力图创造 “地球上表征最为充分的粪便材料”。

Corey Broeckling是科罗拉多州立大学的分析化学核心设施的负责人，其正在帮助研究人员测量粪便样本中的分子。他对飘忽不定的测量结果有切身体会。

Broeckling说：“至今还悬而未决的，就是如何令人信服地展现数据质量。这不仅是为了说服我们自己，更是为了给我们所服务的研究人员和学术社区一个交代。”

肠道微生物组的分析方法是可重复性问题的症结之一。目前最流行的两种方法是宏基因组学和代谢组学，前者是将DNA片段映射到可能存在于肠道的微生物，后者是检测粪便中可能由肠道微生物产生的蛋白质、脂肪等其他分子。Wishart 说：“每个细菌都是一座小小的化工厂，有些细菌会产生好东西，有些细菌会产生坏东西。”

区分肠道微生物代谢物的好坏，有助于研究者了解微生物对宿主健康的影响。例如，一项研究发现，粪便中短链脂肪酸丁酸盐的含量越高，人体对葡萄糖的耐受性就越好³。

代谢物水平的精准测量有助于开发可靠的诊疗方法。然而，目前的代谢物检测技术并不是很准确，且数据往往不能反映肠道菌群代谢组的全貌。首先，粪便样本中含有数千种分子，典型的非靶向代谢组学方法无法鉴定所有分子。Broeckling说：“这倒没什么，后果顶多也就是样本没有被完全表征。”问题的关键在于，不同的实验室可能会使用不同的方法制备和分析代谢组样本。同一台机器的校准结果也会随着时间的推移而改变。对于粪便中到底会有哪些分子或物种，并没有一个准确的真相。

这意味着，当两个实验室分析完全相同的样本时，会得出完全不同的检测结果。即使是同一个实验室对相同的样本进行两次间隔一周的分析，也会得到不同的结果。Wishart 说：“原则上，我们应该得到非常相似的结果，但实际却背道而驰，这对于代谢组学界来说一直是一件令人尴尬的事。”

粪便参照物可以提供帮助。这种东西通常被装在1 ml试管中，看起来很不起眼，其实就是一管大便。这种粪便被分装到成千上万个试管中，因为是以相同的方式、相同的材料制备而来的，所以每个试管所包含的物质都是相同的⁴。

如此一来，每当开展肠道微生物组研究时，各个实验室都可以将一管粪便参照物纳入实验。即使实验之间存在些许差别，研究者可将粪便参照物作为基线，然后报告相对于基线的结果，从而实现跨实验的比较。

例如，实验室A检测的短链脂肪酸水平是参照物的100倍，实验室B检测的短链脂肪酸水平是参照物的1000 倍，那么实验室B的检测结果就是实验室A的10 倍。Fiehn说：“这样一来实验室之间就有了参照。”

科学家们还可以更进一步创造标准参照物（SRM）。他们不仅可以制造许多装有相同物质的试管，还可以精确测量和报告试管中每种分子的含量，这样研究人员就能够以此为基准比对测量结果。“如果你不知道参照物里面有什么，你就不知道你遗漏了什么。” Martha Carlin说。她是The BioCollective公司的创始人，该公司致力于改善粪便样本的储存、处理和运输方式，助力微生物组研究。

在SRM制造方面，NIST可谓轻车熟路，像生产面包和黄油一样。一个多世纪以来，他们一直在制造和销售SRM。1910 年他们发布了第一个SRM ，这是一种石灰石，在石灰石工业中可作为检测痕量矿物质含量的参照物。最近，NIST开始为代谢组学和基因组学等新兴领域制造SRM。例如，SRM 1950是一种血浆SRM，由100个人的血浆混合而成，大约检测了其中100种分子的水平⁵。

十年前，当Jackson来到位于马里兰州盖瑟斯堡的NIST总部时，他首次萌生了制造人体粪便SRM的想法。五年后，他的团队正式启动了这个项目。很快，一系列非常棘手的问题摆在他们面前：样本粘稠度多少才合适？如何确保1000个试管的均质性？如何确保参照物即使放置五年也不会降解？在接下来的几年里，他们逐一解决了这些问题，最终确定了一种液体配方。该配方将多个粪便样本混合在一起，然后用水稀释。

早期的测试批量很小，只有500支试管。NIST通过第三方招募了六名素食者和六名杂食者，并在多日内收集并冻存他们的粪便样本。这两组人的饮食习惯和肠道菌群截然不同。随后，他们将两组样本解冻，并将多人的样本分别混合，同时加水以达到合适的粘稠度，然后分装到1 ml试管中冷冻保存，这样粪便参照物就制作完成了。

Jackson说，这个过程听起来可能比较简单，但其实有很多“吃一堑长一智”的小细节。例如，在早期的工作中，他们发现无法在冷冻的试管上贴标签，所以意识到要在冷冻前给试管贴上标签。

有了这些经验教训，NIST着手处理更大规模的样品。这批样本同样源自素食者和杂食者，并被等分到了多达一万个试管中。目前他们正在测试这些样品的时间稳定性。大批量样品能够为更多研究者提供参照物；一旦这些参照物用完，NIST就必须招募新的粪便提供者，制作新一批均质化产品，并再次进行测试。

关于参照物有一个悖论：参照物是为瞬息万变的科研环境而开发的标准品，但即使是标准品也必须更新迭代。NIST计划于2024年向研究界发布当前这批1.0版本的粪便参照物。他们计划隔年发布2.0版，然后是3.0版，以此类推。

在此期间，他们将对样本中的分子和物种进行更深入的表征。Jackson还不确定他们是否会公布每种代谢物的官方值（即认证值），从而使这些参照物成为真正的SRM。测量认证值是一项成本高昂的工作。拿SRM 1950来说，测量100种代谢物大约需要花费1000万美元和10年的时间。一切都取决于研究界的需求。Jackson说：“我觉得最糟糕的事情莫过于花费大量时间和金钱来开发一些东西，但却无人使用。”

对Jackson来说，了解学术社区对参照物的热情程度也是工作的一部分。他在2019年主导了早期的外部服务拓展工作。他召开了有关微生物组研究标准的会议，与研究人员讨论了粪便参照物的优先级⁶。在这次会议上，与会者一致认为，NIST制造粪便参照物的时机已经成熟。

许多与会的研究者后续都参与了NIST参照物的研发。2020年，NIST给这些研究者所在的实验室分发了由素食者和杂食者粪便制成的初代参照物。这些实验室需要做的是用他们通常使用的代谢组学分析方法对参照物进行分析，给出在素食者和杂食者之间存在差异的前100种代谢物。Jackson的目的是了解不同实验室代谢物分析的一致性。不出所料，“结果五花八门，”他说，“太令人震惊了。”

Fiehn的研究小组也参与了这项测试，并在获得 NIST的许可后发表了测试结果。他们发现在素食者和杂食者之间有近1000种分子存在至少四倍的差异⁷。

这样的测试有时被称为环形比对试验（ring trials）。环比试验仿佛是一面不光彩的镜子，让缺乏标准化的微生物组领域原形毕露。在2019年的一项研究中，14个实验室的研究人员对SRM 1950中的代谢物进行了测量，结果发现在数值上存在巨大差异⁸。不过，这些测试也对代谢组学的实验操作具有指导意义。SRM 1950的环比试验表明，那些设置了对照、使用了高分辨率方法的研究小组往往能得到更准确的测量结果。

加州大学圣地亚哥分校的化学家Pieter Dorrestein也在与NIST合作表征粪便参照物。他的团队只能鉴定其中约15%的分子⁹。他认为这反映了代谢组学一直以来的局限性，那就是人们只能鉴定到具有已知结构的分子。他还认为，人们应该尽可能提供更多有关粪便参照物的高质量数据。他计划在检测工作完成后将数据公开。

对许多微生物组研究人员来说，分析NIST的样品、倡导SRM的应用就是在为领域作贡献。这也是提升他们在领域内的个人价值的一种方式。“如果没有标准和一致的量化概念，科学就不是科学。”Wishart 说。

NIST并不是唯一一个号召各界制定肠道微生物组研究标准的组织。制药公司试图从微生物组研究中寻找潜在治疗靶点，他们也对这些研究缺乏标准化的问题感到担忧。2017年，Janssen公司与NIST合作发起了一场名为“马赛克标准挑战赛”的竞赛。参与竞赛的50多个团队要分析同一批标准粪便样本，检测其中的微生物基因组，然后由专业人士评估检测结果的准确性¹⁰。

马赛克挑战赛所用的标准粪便样本由The BioCollective公司的Carlin团队开发，这是一种可用于宏基因组研究的粪便参照物，已授权给Zymo Research公司，产品名为TruMatrix。这种粪便参照物The BioCollective生产了大约200万瓶，预计可使用10-15年。但Carlin意识到，一切才刚刚开始。Carlin说：“这为粪便参照物的市场需求埋下了种子。”

在微生物组研究领域达到关键里程碑之际，NIST的努力取得了成果。去年，美国FDA批准了首个微生物组药物，名为Reboyta，用于治疗艰难梭菌感染。但这种成功的故事屈指可数。

Carlin说：“微生物组研究已经开展十年了，却没有合适的参照物和统一的标准。”NIST的粪便参照物有望改变微生物组研究的趋势，但前提是人们要使用这些参照物。

这是Jackson最关心的问题。开发参照物是他热衷的工作，但成本高昂。他最担心的是，这一万支试管会在NIST的货架上搁置多年，无人问津、积满灰尘。 “大家都吵着要参照物，” 他说，“我希望那些人会为我们的产品买单，毕竟这是他们的自己主意。”

Wishart 还记得，当SRM 1950发布时，大众接受的速度很慢，原因很简单，那就是缺乏意识。他说：“SRM 1950并没有引起轰动，因为没有人知道它的存在”。高昂的成本也是一个限制因素，每盒产品含有五管1 ml的参照物，成本在1000到2000美元之间。“资源不足的实验室负担不起。”Dorrestein 说。

这些因素已经妨碍了代谢组学现有研究标准的实行。Broeckling参与了一个标准制定小组，名为代谢组学质量保证和质量控制联盟（mQACC）。在撰写文献综述的过程中，他发现很少有人在论文中描述他们所遵循的标准、使用的参照物，许多人压根不使用参照物。Fiehn承认，他有时会为此感到羞愧。尽管SRM 1950触手可及，但有时他实验室的资源不足以支撑大规模研究，或者他们需要优先满足期刊提出的其他质控要求。

那么，如何才能确保新开发的粪便参照物不会石沉大海呢？

 “要让它成为一项社会倡议，” Broeckling说，“要想提高质量控制的水准，就必须要向社会施加压力。”在他看来，大家都责无旁贷。科学家们一定要使用参照物，并在自己的论文中加以强调。监管机构应该强制要求临床前研究使用参照物。期刊编辑和同行评审人员在评估研究严谨性时，应将参照物纳入考量。

Jackson也认为，仅仅制造粪便参照物并不能真正改变现状。他已经与主要期刊和FDA对话，讨论SRM对于评估研究的作用。

归根结底，最能影响科学家的就是他们的同行。像mQACC这样的基层代谢组学社区正在撰写实验操作指南，其中包括一些实验标准及参照物的使用。一群有类似想法的微生物组研究人员也编制了一份名为STORMS的指南，全称是Strengthening the Organizing and Reporting of Microbiome Studies ¹¹。纽约市立大学公共卫生数据科学家Chloe Mirzayi是该指南的主要作者。她知道NIST的参照物即将发布，建议研究人员将阳性和阴性对照纳入实验。她认识到参照物会给本就忙碌的研究人员增加负担，因此，积极的宣传十分重要。

 “人们应该创造一些看起来有用的东西，少一些硬性规定，” Mirzayi说，“应该创造人们真正愿意使用工具或系统，这些东西要能起到实际作用……并且让论文更具影响力。”

参考文献