非常感谢！肠道菌群在结肠癌中的作用一直备受关注，随着这几年肠道菌群领域的发展，解析它们引起疾病的机制越发重要。之前这个领域已经有了很多揭示肠道菌群和结肠癌的相关性的报道，但机制仍然有很大的探索空间。

在这项研究刚开始的时候，大部分人在关注肠道菌群如何通过影响免疫系统进一步影响结肠癌，但我们在思考，作为肠道菌群首先直接作用的一类细胞，肠道上皮细胞的变化是否被忽视了。

通过文献调研，我们发现有些肠道细菌能产生破坏宿主细胞DNA的代谢物，基于这种功能特点，这些代谢物被统称为基因毒素。其中最有意思的是colibactin，这是一种产生于大肠杆菌的小分子代谢物，自2006年被发现以来（Nougayrede, J. P., et al. (2006). Science 313(5788): 848-851.），其功能、作用原理以及化学结构被陆续解析。

colibactin主要在大肠杆菌中被报道，但实际上很多结肠癌的高度相关细菌并不是大肠杆菌。考虑到以前的研究受限于实验技术，我们猜想别的细菌可能也能产生类似功能（即破坏宿主细胞DNA）的小分子代谢物。基于这点，我们决定对炎症性肠病（IBD）病人的肠道细菌做功能性筛选，试图找寻更多的能产生基因毒素的细菌，验证其在结肠癌中的作用。

这项研究主要可以分为四部分。

第一，我们建立了一套基于功能的筛选系统。

考虑到DNA损伤是癌症的一个主要因素，我们利用凝胶电泳的方法，可以快速简单地对细菌是否产生基因毒素以及是否和结肠癌相关做一个初步判断。在对细菌和有特定大小的质粒进行共培养后，通过对质粒进行变性处理可以观察到DNA是否受到损伤以及损伤的可能模式，如交联（cross-linking）、烷基化（alkylation）、降解或酶切等。

采用这个方法，我们惊讶地发现其实很多细菌都能引起DNA的损伤，并与colibactin引起的交联不同。这暗示，基因毒素很可能是肠道菌群的一个广泛存在的性质，也证实了我们的猜想——之前有关基因毒素的研究忽视了很多别的可能。

第二，我们结合了更多评判DNA损伤的方法，并考虑到生理情况下小分子比大分子更容易进入肠上皮细胞发挥作用，认为革兰氏阳性的产气荚膜梭菌和多枝梭菌、革兰氏阴性的摩氏摩根氏菌（Mm）更具研究潜力。

尤其是Mm，在Human Microbiome Project（人类微生物组计划）中显著富集于IBD病人，并被报道与结肠癌高度相关。于是，我们决定对这种菌进行分子和基因层面的机制相关解析。

第三，通过与化学系Jason Crawford和Seth Herzon实验室合作，我们基于功能性筛选和质谱的方法分离有破坏DNA作用的小分子，鉴定出了一类从未被报道过的新型化合物，并根据其结构命名成indolimines。这里我要特别感谢我们优秀的化学方向的合作者，来自Crawford实验室的博士后Joonseok Oh和来自Herzon实验室的博士生薛孟昭。

基于indolimines合成的原理，我们找到了Mm中负责合成indolimines的新型脱羧酶（由aat基因编码）。进一步的大规模随机突变帮助我们得到了一株突变株，证实了aat介导的indolimines合成和Mm的基因毒性。

第四，利用aat特异敲除的突变株，我们证实了其基因毒性在小鼠中能提高肠道通透性和加剧结肠肿瘤，这种效果甚至比产生colibactin的大肠杆菌还要强。

最困难的其实是寻找介导代谢物合成的关键基因以及构建特异性的突变株。这在整个肠道菌群领域都是一个很大的挑战。

首先，我们发现的是一类新的分子，这也意味着没有报道它们是怎么被合成的。我们是根据这类分子的结构，猜想了它们的合成反应。

Indolimines具有N=C的亚胺（imine）结构，这个结构可以由醛类（这里是indole-3-aldehyde）和伯胺（primary amines）自发加合而成。最近一篇文章显示，伯胺可以由最常见的氨基酸通过脱羧基一步反应生成（Kim, D. I., et al. (2021). Nat Commun 12(1): 173.）。

我们从中得到灵感，决定先寻找Mm中有此类效果的脱羧酶。幸运的是，只有3个基因编码的蛋白与之前文章报道的脱羧酶有序列的相似，尽管这种相似可能只有约20%。我们最终找到了aat，并通过异源表达验证了其功能。

另外一个很大的挑战就是验证aat的必要性，需要对其进行敲除。

与细胞不同，细菌的多样性决定了到目前为止还没有一个好用的普遍性基因编辑技术，每种菌可能都需要不同的方法才能转入基因编辑工具。而且，很多肠道细菌都具有抗生素抗性，很难找到一个好用的筛选方法。

当时我们考虑了Cas9，试了同源重组和最终文章报道的转座子插入（transposon insertion），通过对实验细节进行各种优化，我们才成功地利用转座子插入构建了突变库。但这个方法是一个非特异性的敲除，为了从16 000个克隆里找到我们想要的aat基因敲除，我们优化了Knockout Sudoku和转座子测序（Tn-seq）技术，终于幸运地得到了一株突变株。有了这个突变株，我们才能证明aat的必要性，才能在后续的实验通过严格的头对头比较，证明indolimines介导的Mm的作用，而不是仅仅将Mm与别的细菌进行比较。

相同之处只能说它们都是小分子代谢物，并且这篇文章中鉴定的indolimines产生于Mm，与产生colibactin的大肠杆菌一样都是革兰氏阴性菌。

与colibactin不同的一个主要地方在于，我们在最初的筛选阶段发现的具有基因毒性的细菌，包括18个菌株，其细菌上清就有破坏DNA的效果，说明相较于colibactin它们更加稳定、易分离。

之前广泛报道的colibactin发挥作用需要用细菌感染细胞，可能是由于需要细菌与细胞直接接触，才能通过细菌的分泌系统将colibactin转运到细胞内，也可能是因为只有直接接触才能保证在接触面有足够高浓度的colibactin，具体的机制目前仍不清楚。

其他不同之处还在于，我们并没有发现还有像colibactin一样能够交联DNA的基因毒素。根据凝胶电泳和indolimines的化学结构，我们猜测它们是通过烷基化来破坏DNA分子的稳定性，从而导致DNA的断裂。

另外，负责合成colibactin的是clb 基因簇（gene cluster），我们并没有在其他细菌中找到类似的生物合成基因簇。当然，这也有可能是因为目前对于肠道菌群基因的注释还不够充分。

我虽然也非常看好活菌药和益生菌的发展，但也希望这个领域不会被滥用，尤其是在选用菌株的时候，我们确实需要更加严谨。

近几年，越来越多的人在宣传肠道菌群的好处，但作为研究者还是不能头脑发热只做大家希望听到的结果。希望我们的研究也能防止大家头脑过热，并在转化的时候多提前思考可能的隐患，做好预防再给人使用，或使用后做好追踪来适当停用。

另外，其实我们在研究中发现很多细菌都具有破坏DNA的效果，提示这可能是细菌的一种广泛特征。虽然这篇文章主要聚焦于结肠癌，但基因毒素可能有着其他的作用，比如重塑肠道菌群的组成，或是细菌之间互相竞争的一种机制。

考虑到人的肠道菌群已经是一个复杂的系统，如何让新引入的细菌成功融入已有的系统并发挥作用，也是转化上会遇到的挑战。

我们对于Mm的研究仅仅是初步揭示了基因毒素的冰山一角，别的细菌产生的新基因毒素也是未来可以研究的方向。在我们文章的讨论部分有提及，产气荚膜梭菌和多枝梭菌也促进肠癌的发生，但它们并不产生indolimines。

另外，由此延伸出的其他生物学和化学问题也非常有意思。比如，这些基因毒素到底是如何进入细胞的；这些分子是如何与DNA结合的；是不是所有的基因毒素都像colibactin一样能针对特定的DNA序列进行破坏；如果能识别出其特征序列，能否在人的肠癌基因库中看到Apc、Tp53等关键基因上有这类突变等。

我本人将在北京脑科学与类脑研究中心开展博士后研究，重点关注肠道迷走神经的功能。这个兴趣来源于我博士期间的另一项工作，有关肠道微生物的代谢产物是否影响神经细胞的激活和痛觉产生。

由于我本身在神经科学没有接受过科研训练，希望接下来几年可以先深入学习神经科学，未来做好肠道微生物和其他系统及人类疾病的交叉研究。