各位肠道的观众朋友们，大家好。非常感谢热心肠研究院，提供这样一个机会和大家进行交流。
我是来自北京大学化学与分子工程学院的王初，我的研究专长是化学生物学。今天我想跟大家进行交流的报告题目是《中药降脂活性的靶标鉴定和机理研究》。
我想大家对脂肪肝都并不陌生。
脂肪肝它的诱因有两种：一类是由酗酒引起的，我们把它叫做酒精性脂肪肝；还有一类非常重要，是由于代谢紊乱引起的，叫做非酒精性脂肪肝。
在肝脏的正常代谢过程当中，一旦代谢出现紊乱，特别是一些脂质不能被有效地清除的话，它就会在我们的肝组织当中被大量的堆积，这个阶段我们把它叫做脂肪肝。
但时间比较持久了之后，堆积的脂肪会促使肝细胞产生大量的炎症反应，那么慢慢地会演变成非酒精性脂肪性肝炎，进而造成组织的纤维化，导致了肝硬化，最后导致肝癌的发生。
非酒精性脂肪肝其实是一类非常大的代谢性疾病。在脂肪肝的早期阶段，我们能够在显微镜下看到，肝脏组织当中有大量的白色脂滴的形成和堆积。
非酒精性脂肪肝其实和肥胖、心血管疾病、高血糖、高血脂、胰岛素抵抗都是密切相关的。
那么，对于脂肪肝的治疗，如果去医院的话，大夫们都会说脂肪肝不是病，少吃点大鱼大肉，多加强锻炼，注意休息就好了。
我们在想，有没有什么办法能够对它进行治疗，或进行药物的调控。
我们从早期的一个中药研究的原始文献中，发现了一个灵感。
在这篇文献报道的一个内容，主要是一个天然产物，叫做黄芩苷，在老鼠的模型当中对于脂肪肝有非常好的降脂效果。
大家可以看到，用正常饮食进行喂养的老鼠，它的肝脏组织切片用一种叫油红的染料进行染色的时候，你会发现它里面并没有很多的脂肪堆积，颜色不会是发红色的。
而在中间的用高脂饮食喂养的时候，你会发现老鼠的肝脏进入油红染色的时候，里面有大量的脂肪堆积，颜色是非常红的。
如果在喂高脂的同时给老鼠喂了一个天然产物黄芩苷，会发现脂肪的堆积的程度明显减轻了。
黄芩苷是什么呢？顾名思义，黄芩苷其实就是我们大家非常熟悉的中药黄芩的主要成分。
右边的这张图给大家展示的，就是黄芩苷的具体的化学分子结构。从化学结构上来说，黄芩苷属于黄酮类化合物，但是这类化合物在黄芩这个中药当中占的成分是非常高的，占了整个黄芩的 10%的干重。
那么，黄岑苷到底怎么样能够产生这样降脂的效果？它降脂的机理是什么？
我们知道，一个小分子进入细胞之后，一定会在细胞当中跟细胞内的某一类蛋白质发生相互作用，从而调控这个蛋白质的功能，产生了新的细胞表型。
因此，我们想回答的问题就是：黄芩苷是如何来发挥降脂功能的？它在细胞内的具体的作用靶标是什么？
说到这儿，大家会想到，作为一个细胞来说，可能它是一个简简单单的细胞，但是它里面所包含的蛋白质的种类是成千上万的，是非常复杂的。我们把这一类复杂的蛋白质的组成，叫做细胞的蛋白质组。
如何能够在这么多的蛋白当中找到黄芩苷的作用靶标？也就是找到黄芩苷具体和这里面的哪个蛋白有相互作用。那么就需要我们发展新的化学生物学的技术，来实现在蛋白质组内，进行这种“大海捞针式”的研究。
我们用到的这个技术就是叫做“基于活性的蛋白质组分析技术”，或者简称把它叫做 ABPP。
在这个技术当中，我们需要利用化学合成的方法，将我们感兴趣的化合物进行化学改造，把它做成一个我们叫做探针的工具。
这个探针当中有两个最主要的部分。一个部分是像钓鱼的钩子一样，当它进入细胞了之后，可以把它跟它相互作用的蛋白勾住。同样，你在钓鱼的时候把鱼勾住了，你还需要有一个鱼竿，能通过鱼线把这个鱼给抓上来。所以，我们在探针上面还会要设计一个像把手一样的基团，当这个探针捕捉到它相互作用的蛋白之后，就可以把它从细胞里面捕捉出来。
然后通过成像的方法，看到这些蛋白质的定位，甚至可以通过生物大分子质谱，帮我们进一步的分析这些被钓出来的蛋白的具体成分。
这个技术是化学生物学领域当中一个非常新兴的技术，在很多的药物靶标的鉴定当中都起着非常重要的作用。
回到黄芩苷的故事上，我们首先就要将黄芩苷这个化合物进行它的探针的改造。我们通过化学合成的方法，合成了一个带有“钩子”和“把手”的黄芩苷的分子探针。
那么，探针改造了之后，黄芩苷的探针还有没有天然黄岑苷化合物的活性呢？
我们做了相应的实验。可以看到，在黄芩苷能够降脂的同时，黄芩苷的探针也有类似的生物活性。这样，我们就可以非常放心的将这个探针应用于后续的靶标鉴定当中。
我们采用 ABPP 技术，在高脂喂养的小鼠肝细胞当中，进行黄芩苷的捕捉。
为了进一步降低我们捕捉的蛋白质的背景噪音干扰，我们又利用了化学同位素标记的方法，将细胞用轻和重的同位素进行标记，然后通过黄芩苷的探针进行捕捉。但在其中的一组样品当中，我们还加入了天然的黄芩苷，和探针进行相应的竞争。可以想象的是，加入了天然黄芩苷这一组，它和探针发生竞争之后，探针的标记能力就减弱了。因此，探针抓到的蛋白可能也就会偏少。
最后通过生物大分子质谱，我们可以对轻、重同位素标记的从细胞里面捕捉到的蛋白进行比较，差异越大的，我们就认为是黄芩苷能够非常有效结合的相互作用蛋白。
通过这项技术，我们在细胞当中捕捉到了将近 150 个高置信度的黄芩苷结合蛋白。
对这些蛋白我们进行了生物通路的功能分析。让我们非常惊喜的是，我们在这些通路分析当中，找到了一类非常重要的在细胞内能够降解和消耗脂肪酸的途径，也就是我们大家非常熟悉的脂肪酸 β 氧化通路，这个通路在细胞内主要负责消耗和代谢脂肪酸。
我们细胞内的脂肪酸需要进入到线粒体，才能发生脂肪酸 β 氧化的整个过程。脂肪酸进入到线粒体当中非常重要的一个关键的蛋白酶，叫做棕榈酰肉毒碱转移酶，英文简称为 CPT1。这个蛋白相当于是脂肪酸进入到线粒体当中的一个 bottleneck（瓶颈），也就是起“守门人”作用的一个蛋白。这个蛋白一旦出了问题，那么脂肪酸就没有办法进入到线粒体当中发生 β 氧化，从而不能消耗脂肪，也不能够给细胞提供能量，细胞就会出问题，因此这个蛋白非常的重要。
当我们看到在黄芩苷的相互作用蛋白当中，有这样一个跟脂肪酸代谢密切相关的蛋白的时候，我们就快速的聚焦到去进行相应的验证，看一看这个蛋白的功能是不是能够被黄芩苷所调控，从而使黄芩苷产生对细胞的降脂活性。
我们首先通过 RNA 干扰技术，将 CPT1 蛋白在细胞内进行表达量的敲低。我们发现，在正常的细胞当中，加入黄芩苷之后，它有 50%左右的降脂活性。然而，CPT1 被敲低的这些细胞再加入黄芩苷的时候，它原来的降脂活性就消失掉了。这说明，CPT1 这个蛋白在黄芩苷的降脂活性当中发挥着非常重要的作用。
具体是怎么样发挥这样的作用呢？我们又通过生物化学的酶活检测，去检测了在细胞内加入黄芩苷之后对 CPT1 酶活的影响。我们非常惊喜的发现，黄芩苷能够非常有效地激活 CPT1 的酶活。这跟我们的表型是非常吻合的。
我们再回忆一下，黄芩苷有非常明显的降脂活性，而我们现在又发现，黄芩苷能够激活在脂肪酸代谢通路当中非常重要的一个酶，加速细胞内的脂肪代谢。这样的话，细胞内的脂肪的堆积就会减少。
更加有趣的一个事情是，CPT1 这个酶在我们的身体各个组织内，都广泛地表达。它有 3 个非常重要的亚型，包括在肝脏内的这个亚型，叫做 CPT1A，还有在肌肉当中表达的亚型，叫做 CPT1B，和在脑部组织当中表达的另外一个亚型，叫做 CPT1C。
我们发现，黄芩苷只对在肝脏当中特异性表达的亚型 CPT1A，有一个非常明显的激活效果，而对另外两个亚型并没有激活的作用。可以看得出来，黄芩苷能够去特异性的激活肝脏中的脂肪代谢，从而达到改善脂肪肝病症的效果。
在进一步的探索当中，我们又用了一个叫做“热稳定性漂移”的实验，来检验了黄芩苷跟 CPT1 的相互作用。
我们发现，加入了黄芩苷之后，CPT1 的酶的稳定性也发生了明显的变化，它的稳定性变高了。这个证据能告诉我们，黄芩苷可能跟 CPT1 存在着直接的相互作用。
由于 CPT1 这个酶的结构非常难以解析，因此我们采用了计算支持的分子对接模拟的方式，来预测黄芩苷和 CPT1 的相互作用。
如这个图当中所示，我们可以看到，我们预测到一个黄芩苷跟 CPT1 蛋白非常好的一个结合口袋，而在这个口袋当中，有 4 个很关键的氨基酸，都起着非常重要的作用，从而让黄芩苷这个小分子能够和 CPT1 这个蛋白酶发生相互作用。
如果我们将这个结合口袋当中预测的这 4 个氨基酸的任何 1 个进行突变的话，都会影响黄芩苷和 CPT1 酶的相互作用。
可以看到，我们做了这个突变之后，黄芩苷不会再影响 CPT1 蛋白的热稳定性，同时，只有野生型的蛋白能够被黄芩苷所结合，从而产生酶的激活，而其它的这些突变体的蛋白，就不能够再被黄芩苷所激活了。
所以，这些实验的证据进一步表明，黄芩苷能够直接结合 CPT1 蛋白，然后激活这个酶的活性，从而加速了细胞内的脂肪酸代谢，降低了脂质的堆积。
在这些生化和细胞实验的层面基础之上，我们又在动物的模型上进行了探索。
这个模型也很简单。
在老鼠的喂养过程当中，我们给它一组喂正常的饮食，而另外一组喂高脂的饮食，就像我们人吃大鱼大肉一样。给高脂喂养的老鼠在喂了 3 个月之后，我们再开始给它喂黄芩苷。喂黄芩苷的时候，高脂的饮食并没有停止，而是一直的喂下去。
我们可以看到，在最开始的时候老鼠的体重是一样的。而喂 3 个月高脂饮食之后，高脂喂养的老鼠的体重明显的比对照组要重了很多，这也是符合我们的预期的。
而在此基础之上，高脂喂养的老鼠在同时喂了黄芩苷之后，只喂了大概 4 周左右的时间，就是 1 个月的时间，老鼠的体重就明显的降低了。而在后面两个月的过程当中，我们继续喂养黄芩苷，老鼠的体重并没有再反弹回去。
所以从这个结果看，黄芩苷似乎有非常明显的降低体重和减肥的效果。
在老鼠喂养实验结束之后，我们对老鼠进行了解剖。
我们可以明显的看到，高脂喂养的老鼠的体型是非常的肥大，在它的肝脏里面有大团大团的脂滴形成，这个是很明显的脂肪肝的症状。
而喂了 3 个月的黄芩苷之后，它的体型跟正常饮食喂养的老鼠几乎没有差异，肝脏的大小也是非常正常的。再去看它肝脏的组织切片的染色发现，它的脂肪的堆积已经看不见了。它的胰岛素抵抗，包括它的肝功能，都有明显的改善。
所以，可以看得出来，黄芩苷的喂养可以整体的有效的改善，肥胖带来的这种代谢综合征的症状的程度，让脂肪肝的症状进一步得到改善。
大家会想到一个问题，给老鼠喂黄芩苷，就相当于天天给它喂中药汤喝，这个味道肯定不好。老鼠是不是因为天天喝了中药之后，它就不愿意再去吃更多的食物了呢？
在喂养的过程当中，我们也通过了一系列的代谢的实验，去监测老鼠在这个过程当中的饮食的摄入量，还有它的能量的消耗，呼出的二氧化碳，以及吸入的氧气的量。通过这些代谢指标我们来判断一下，老鼠在这个过程当中它的代谢发生了怎么样的变化。
我们可以看到，高脂喂养的老鼠整体吃的饮食的重量会少，因为高脂饮食单位重量的能量摄入是要比正常饮食要高的，所以它的整个整体的食物的摄入量比较少。黄芩苷的喂养并没有改变老鼠的整体饮食摄入，但它的能量消耗，也就是它的耗氧量发生了很明显的变化。
黄芩苷喂养的老鼠，它的耗氧量明显增加。而且如果通过一个更专业的指标，叫做“呼吸熵”，测的就是呼出的二氧化碳和吸入的氧气的比例。这个指标反映了一个正常的生物体，在维持它正常生命活动时候的能量消耗的来源。呼吸熵越接近于 1 的时候，说明机体更多的是用糖类，比如说葡萄糖，来作为它的能量的来源；而这个呼吸熵越接近于 0.7，则代表在消耗更多的脂肪。
我们可以看到，通过黄芩苷来喂养的这些老鼠，它的呼吸熵的测定的指标更接近于 0.7，也就是说在这个过程当中，它更多的在消耗脂肪来作为它的能量来源。通俗的讲，它能够燃烧体内更多的脂肪，这和黄芩苷的降脂的活性是非常的吻合的。
因为我们之前发现了 CPT1 的蛋白当中的几个突变体，它是不能够被黄芩苷所激活的。因此，我们将这几个突变体其中的一个引入到了小鼠的肝脏当中。
我们发现，正常的野生型的老鼠能够对黄芩苷有非常好的响应，它的体重能够下降，同时它的肝脏的症状能够得到非常好的改善，脂肪肝的脂质的堆积大量的降低。而如果将对黄芩苷没有响应的、不能被黄芩苷所激活的突变体的蛋白引入到老鼠的肝脏之后，我们发现这类突变型的老鼠在喂养了黄芩苷之后，它的体重就不会再下降，同时它的肝脏脂质的堆积也并没有减少。
这些实验进一步的证明了，黄芩苷这个天然产物是通过结合并激活了 CPT1 蛋白，从而达到减肥降脂的功效。
简单的来总结一下。我们今天的报告里面，给大家介绍了一个非常前沿的化学蛋白质组学的技术——ABPP。我们通过这个技术可以在复杂的组织或细胞的样品当中，系统地发现一个小分子的结合的靶标。
在这里，我们发现的是黄芩苷的结合靶标。在发现了靶标当中有很多跟脂肪酸代谢通路相关的蛋白之后，我们又进行了分子和生化酶活的实验，发现黄芩苷这个小分子能够有效的去结合脂肪酸代谢酶 CPT1，并且能够激活酶的活性，加速细胞内脂肪代谢。
然后，我们又进一步的通过计算模拟和分子对接的方式，预测并验证了黄芩苷与 CPT1 蛋白的小分子和蛋白的相互结合的界面。最后，我们在动物模型和代谢的实验中，进一步的证明了黄芩苷可以有效的通过激活 CPT1 酶，达到改善肥胖和脂肪肝症状的效果。
从未来的角度来看，我们发现了一个在中药当中的黄酮类的天然产物，有一个非常有趣的减肥和降脂的功效，而且我们找到了它潜在的分子靶标。我们知道，黄酮类的化合物在自然界当中非常的丰富，有超过将近 5000 种不同类型的黄酮化合物。
那么，这一类的化合物是不是都有类似的效果，有待于我们进一步的通过高通量筛选的办法进行发掘。也许我们能够找到比黄芩苷更好的天然产物，能够达到减肥和降脂的功效，为这类的药物的研发奠定前期的基础。
那么，我最后还想再强调一下，化学蛋白质组学技术 ABPP，不仅能够去做天然产物的靶点鉴定，其实它可以适用于不同类型的活性分子。这类活性分子可以是天然产物，也可以是内源的代谢分子，譬如说我们之前的一个工作，就鉴定了肠道代谢非常重要的一类分子胆酸的相互作用蛋白。同样的，我们也可以将这个技术用在一些化学合成的抑制剂分子，或者是临床的一些药物，来评估它的副作用当中产生的脱靶效应。也可以通过这种方式，挖掘到很多新的靶点。
我们大家都知道，在肠道菌群当中有不同类型的微生物，它们可以产生不同类型的、活性的、结构特异的化合物，来跟宿主进行相互作用。这类相互作用的分子机制的解析，在未来我相信也会用到这样的化学蛋白质组成的技术。
因此可以看到，化学生物学技术的发展，能够进一步的推动生物学机制的研究。
最后我要感谢戴建业博士，当时在我课题组主要负责了黄芩苷降脂的靶点鉴定和机制研究的总体工作，还要感谢我们的合作单位和提供经费支持的基金。
右下角是我们自己课题组的公众号，每周定期的给大家介绍化学生物学前沿的一些文献，也欢迎大家关注。
谢谢大家！
