大家好，我是中国科学院青岛生物能源与过程研究所的张佳。
非常开心，也非常荣幸能够有这样一次机会来到我们热心肠研究院，为大家一起分享基于单细胞拉曼光谱的益生菌产品的深度质检技术。
什么样的益生菌产品是靠谱的？
益生菌产品日趋火热，面对市面上五花八门的益生菌产品，消费者往往会提出这样的疑问：到底什么样的益生菌产品才是靠谱的？
目前关于益生菌产品的一系列的负面新闻也越来越多，包括低价的益生菌产品没有标注货架期内的活菌数，包括标注的菌种信息与它的实际情况不符等等一系列的问题，更增加了消费者的困惑。
对此，国家也有相对应的法律法规，比如要求作为一个食用级的益生菌产品，它必须每克或者是每毫升达到活菌数107或者108CFU。
但是目前的法规只对总活菌数有要求，对于菌种鉴定是可选项，更不会对于一个益生菌产品的每株菌的代谢活力情况或者是活菌情况进行要求。因此，无疑增加了目前益生菌产品的鱼目混珠现象。
其实，这主要受限于目前现有检测技术的局限性。
现有技术检测主要是依赖于DNA测序或者平板培养技术，这样的一些技术存在着耗时长、费时、费力以及无法测量菌株的原位代谢活力等局限性。
我们也通过一张图片，列举了目前基于传统方法的益生菌产品质检的总体流程以及它的局限性。
我们分别从计数、菌种鉴定、代谢活力和溯源四个方面进行讲解。首先，传统方法采用血球计数板进行总菌计数，平板计数实现总活菌计数。菌种鉴定，主要通过测序或者一些生化反应，来实现它的菌种鉴定。代谢活力情况，主要是通过基于荧光的一系列检测方法。溯源，是通过挑取单克隆来实现菌种层面的全基因组测序。
我们在这里面列举了它在4个方面的局限性。
首先，它需要依赖于培养，因此存在着耗时长的缺陷，我们认为“不够快”。
其次，它难以实现定量的细胞代谢活力及细胞间异质性的检测，我们认为“不够准”。
第三，它不能够实现对于复合益生菌产品的深度质检，因为传统的技术方法无法实现对一个益生菌产品中每一株菌株的精准的深度判定。因此我们认为“不够深”。
第四，传统的技术方法需要多种检测手段的交叉验证，它的实验步骤和实验仪器操作复杂，需要多台仪器、多个步骤才能够实现。因此它难以实现一体化，我们认为“不够易”。
什么样的检测技术是靠谱的？
针对传统方法的这些瓶颈性问题，我们在iMeta上发表了一篇基于单个细胞层面的益生菌产品的深度质检技术，我们给它命名为SCIVVS技术。
它可以直接从产品出发实现益生菌产品的原位检测，它可以采集益生菌产品的单个细胞的拉曼光谱。通过拉曼光谱的指纹区来告诉你菌种鉴定的结果，通过拉曼光谱的静默区的碳-氘（C-D）峰来告诉你细胞的死活情况以及它的代谢活力情况。
SCIVVS技术可以在4~5个小时内通过一次拉曼的光谱采集，实现多指标的质检结果。在溯源方面，它可以直接分选益生菌产品的单个细胞，并且完成单个细胞水平的全基因组测序，从而实现精准溯源。
因此，SCIVVS技术具有耗时短，能够揭示细胞间异质性，不依赖于先期的培养，实现对复合益生菌产品的深度质检，以及易于一体化和自动化等优势。
因此，我们提出的解决方案是单个细胞精度的代谢表型组和基因组，而且它具有快、准、深、易等优势。
今天我们主要讲解一下这个技术的技术原理以及一些应用场景。
首先是它的技术原理，它可以实现单个细胞精度的代谢表型组。我们认为一个细胞具有特定的单细胞拉曼光谱，它刻画的是一个细胞的代谢状态。
我们把这个细胞分成两个区，分别是指纹区和静默区。
指纹区，它指征的是一个细胞内含有特殊物质的一些特征峰，包括一些大分子物质，比如说蛋白质、脂质等等。那么不同的细胞含有的这些组分是不同的，因此它呈现的指纹峰是不同的，就类似于人的指纹识别。基于这样一个原理，它可以实现单个细胞层面的精准菌种鉴定。
静默区，正常情况下是没有明显的特征峰。但是我们对一个产品进行质检的时候，会进行重水的孵育。在重水孵育的过程中，有代谢活性的一些细胞就会“喝”重水，从而产生C-D峰。通过C-D峰就可以指示一个细胞的代谢活性，从而判别细胞的死活情况。
基于这样的原理，SCIVVS技术就可以通过一次的拉曼光谱采集，实现菌种鉴定、代谢活力检测以及细胞的死活鉴定等等。
首先是在死活计数和代谢活力的快速检测方面的原理。我们前面讲的，对一个细胞进行质检的过程中会进行简单的重水孵育，有代谢活性的这些细胞就会喝重水，从而产生了一个C-D峰。
正常情况下细胞喝普通水时，它产生的是一个碳-氢峰（C-H峰），我们利用C-D峰/（C-D峰+C-H峰）得到的比值，叫C-D Ratio值，就可以反映一个细胞的代谢活性。
通过这样一个C-D Ratio值，我们可以得到一系列的定义，包括代谢活性水平（MAL）和相对代谢活性水平（rMAL）。
代谢活性水平，就是利用了一个益生菌产品孵育了3个小时的C-D Ratio值减去0小时的C-D Ratio值。为什么要减掉0小时呢？就是为了去掉一些拉曼的背景信号。
相对代谢活性水平，就是利用一个菌株在产品的原位MAL值比上纯培养过程生长到对数期的MAL值。我们一般认为，一个菌株在纯培养的对数期，它的代谢活性水平是最强的。因此我们把MAL值作为分母，获得的比值就叫做相对代谢活性。它指示的是一个菌株在产品的原位，相对于菌株本身最强的代谢活力的相对代谢活性水平。
为什么是3小时的重水孵育呢？
因为我们前期做了一个重水孵育条件摸索的实验。我们对一个益生菌产品通过不同的重水浓度孵育了不同的重水时间。
结果我们发现，在75%和100%的重水孵育了3个小时的时候，细胞都能够达到一个饱和的状态；75%的重水孵育的时候，时间会影响细胞的计数结果，3小时的孵育会导致一些细胞繁殖，从而影响了细胞的结果；100%的重水孵育没有产生明显的差异，因为100%的重水本身对于细胞的繁殖是有一定的抑制作用。
因此，最终我们选用的孵育条件是100%的重水孵育3个小时。
益生菌产品单细胞质检能做什么？
精确活菌计数
基于这样的前期实验，我们就获得了MAL和rMAL的一系列的定义，并且对一系列的益生菌产品进行质检。
首先，这里列举是一款单一益生菌产品的质检结果。我们分别利用SCIVVS技术与传统的血球计数板、活菌计数分别进行计数。结果发现，我们的计数结果与传统的计数结果，通过T-test检验没有显著性的差异，证明了我们技术的可靠性。
值得一提的是，我们得到的总活菌数往往会比传统平板计数结果的数值要偏高，而且这种现象在对一系列的益生菌产品进行质检的过程中会反复地出现。
我们认为部分单细胞有一定的代谢活力，但是这些代谢活力不足以让它长成一个克隆。因此利用传统的平板克隆计数法是无法被计数到的，而利用单细胞技术可以被精准计数。因此在这个层面上，我们的计数会比传统方法更为精准。
当然SCIVVS技术不仅仅是在于活菌计数更为精准方面的应用，它还可以实现代谢活力的定量，不仅仅能告诉你这个细胞的死活情况，还能够告诉你这个细胞活的怎么样，比如非常活跃、一般活跃，还是半死不活的状态。
评判产品工艺
代谢活力有哪些的应用场景呢？我们这里面列举了一个益生菌产品不同生产工艺的评价。
传统对于益生菌产品不同工艺的评价，是基于活菌数或者是活菌率的。比如说一个婴儿双歧杆菌通过不同的加工工艺，一个没有进行包被的加工工艺命名为产品X，另外一个是经过了加工工艺命名为产品Y。传统的评价工艺的方法是对这两个产品进行计数。首先它们生产出来了之后就进行一次计数，发现产品Y是109，产品X也是109，根本无法区分这两个产品的好坏。
因此往往会需要一个加速实验，就是说把这个产品放在一个相对高温的条件下，比如37度，放置10天甚至一个月两个月或更长的时间。10天之后再一次地对这两个产品进行活菌计数发现，产品Y还是保持109，产品X已经降低到107。
通过活菌数和活菌率的评判会发现，产品Y的加工工艺更好，从而实现了产品工艺的评价。
而SCIVVS技术无需10天的加速实验，可以在5个小时内通过代谢活力定量和活力的异质性来直接告诉你答案。
通过代谢活力，能够告诉你产品Y的代谢活力是更强的；通过细胞间异质性指数，告诉你产品Y不仅代谢活力强，而且它们之间更均匀。因此，产品Y的加工工艺效果是更佳的。
精准菌种鉴定
接下来要讲的是SCIVVS技术在菌种鉴定方面的原理及其应用。
每一个单细胞都有它的拉曼光谱，其中一个区叫指纹区，它含有很多的特征峰，其实就是细胞内的一些主要的组分，包括蛋白质、脂质等等一些大分子物质。不同的单细胞含有的这些组分是不同的，因此它呈现的特征峰是不同的。
基于这样的原理，我们就能够实现一个产品的精准菌种鉴定。
我们首先构建了21种法定的可食用益生菌的单细胞拉曼光谱数据库，然后基于深度的学习，最后我们从产品直接出发，能够实现准确率高达93%的鉴定结果。因此，我们认为这个技术可以实现益生菌产品的精准的菌种鉴定。
另外我们也进行了一个模拟实验，比如我们将植物乳杆菌和非植物乳杆菌分别按照1:100到100:1的比例进行混合。结果发现，我们的预测结果与实际混合比例的结果基本一致。而且与实际的情况相比，它的差异小于3.5%。
再一次地证明了这个技术可以实现益生菌产品菌种的精准鉴定。
溯源单细胞全基因组
另外，SCIVVS技术还可以实现单细胞层面的全基因组溯源。
具体的就是，我们分选出益生菌产品中的单个细胞，然后实现单个细胞的全基因组测序。我们最高的单细胞扩增的覆盖度能够实现高达99%以上，从产品出发能够实现高达89%以上。因此，这个技术可以从单个细胞层面直接来实现益生菌产品的精准溯源。
质检复合产品
最后我们通过一款复合益生菌产品，来系统地展示一下SCIVVS技术在质检复合益生菌产品方面的强大应用。
首先，它能够告诉你传统方法也能够告诉你的答案，如总的活菌数、总菌数以及活菌率。
同时我们也进行了传统的平板计数和血球计数板计数的方法作为对照组。通过T-test检验发现，我们的计数结果与传统的计数结果相比，没有显著性的差异，再一次地证明了这个技术的可靠性。
其次，它还能够告诉你传统方法不能够告诉你的答案。在菌种鉴定方面，可以告诉你复合益生菌产品中有哪五种菌，这五种菌的比例是多少。我们的判定结果与实际的比例进行比较会发现，没有显著性的差异，再一次地证明了这个技术的可靠性。
不仅如此，它还可以告诉你，这个复合益生菌产品里面每一株菌的代谢活力水平、相对代谢活力水平和细胞间异质性。
它可以对复合益生菌产品在4~5个小时内通过一次检测，就能够获得一系列质检指标，告诉你一系列质检结果，从而完成深度的质检。
在溯源方面，SCIVVS技术可以直接从产品出发，分选出单个细胞来实现单细胞水平的全基因组测序。最低的覆盖度能够做到46.28%，最高的覆盖度能够做到99.07%，即使是最低的覆盖度也能够实现精准的溯源。
结语
最后进行一个简单的总结，我们基于自主研发的一台仪器和自主研发的益生菌试剂盒，最后构建了基于单细胞拉曼的一体化益生菌产品的多指标指征，包括总菌数、总活菌数、菌种鉴定、代谢活力以及细胞间异质性和溯源等等。
与传统方法比较，首先是“快”，可以在5个小时内完成快速质检，比传统方法快20倍，从而节省了产品的上市等待时间。
其次是“准”，可以实现益生菌产品的多指标指征，包括计数、ID、代谢活力等等，从而杜绝市面上一些鱼目混珠的现象。
再次是“深”，可以实现对复合益生菌产品中每株菌株的深度质检。
最后是“低成本”，会比传统方法更便宜，因为它的质检只需要1微升。
因此，SCIVVS技术可以直接从益生菌产品出发，对益生菌产品进行原位的检测。通过采集益生菌产品原位的单细胞拉曼光谱，指纹区可以告诉你菌种鉴定的结果，静默区的C-D峰可以告诉你细胞的死活情况以及代谢活力情况。
另外可以分选出益生菌产品的单个细胞完成全基因组测序，实现精准溯源。
目前益生菌的快检技术应用的范围会越来越广泛，包括食品、医药、农业等等。SCIVVS技术作为一项具有广泛应用前景的质检技术，必将为人类健康保驾护航。
谢谢大家！
