大家好，我是刘万里，来自清华大学生命学院和清华大学免疫所。
非常高兴接受热心肠研究院的邀请，有机会向大家汇报我们实验室在人的IgG1抗体编码基因的一个变异体，如何通过影响肿瘤的微环境来调控结直肠癌发生发展的相关研究工作。
对于我们的肠道，每个人是非常熟悉的，肠道是我们机体跟外界接触的一个界面。每天，我们的肠道都会接受着来自食物、饮料或者病原体对肠道的刺激。
因此，相比较于机体的其他一些器官和细胞，肠道相关细胞发生体细胞突变的概率和数量处于偏高的位置。
大家也可以想象，作为肠道疾病的一种，结直肠癌的发病率在全球范围内都是偏高。尤其在中国，无论男性还是女性，以结直肠癌为代表的消化道肿瘤严重地影响并威胁了我国人民的健康和生命。
针对结直肠癌的相关研究是重要的，也是必须的。
作为健康人，机体的结直肠相关细胞是有可能发生癌化的，但是他们并没有表现出结直肠癌的特征。其核心的根本原因，是因为每个健康的机体都存在强有力的免疫力，这是由我们的免疫系统提供的。免疫系统时刻监视着发生癌化的相关细胞，包括结直肠癌细胞，并且精准地、及时地予以消灭。
在这方面，不同的免疫细胞类型如何做出贡献呢？
聚焦肿瘤微环境内的B淋巴细胞
对于结直肠癌细胞的识别和清除，不同的实验室从不同的角度都予以了关注和研究。我们实验室一直聚焦在免疫细胞中的B淋巴细胞，这类细胞主要负责产生抗体。
它们如何在肿瘤微环境过程中精准地完成对肿瘤相关抗原的免疫识别，进而协助我们机体的免疫系统清除结直肠癌细胞呢？
B淋巴细胞表面存在的特异性抗原受体，叫B细胞受体，简称BCR。它对来自肿瘤细胞或来自受感染机体细胞等不同种类的抗原进行识别，进而启动B细胞的增殖、活化，产生抗体。
B细胞有比较复杂的发育、活化、增殖和分化的过程。
比如说，初始型B细胞负责的是刚开始碰到肿瘤相关抗原或病原体感染细胞，产生病原体蛋白的抗体应答反应。但是当机体形成了抗体记忆，或者说形成免疫记忆以后，主要是由IgG型记忆性B细胞对外来抗原（包括肿瘤抗原）进行识别，产生以抗体记忆为特征的抗体应答反应。
我们的前期工作发现，编码人的IgG1模联型抗体重链的胞内区存在一个396位的从甘氨酸到精氨酸的突变（G→R），这个变异体降低了IgG-BCR活化的阈值。
也就是说，携带这样变异体的B细胞能够更好地驱动活化、增殖，并向浆细胞分化。因为浆细胞，是最终产生抗体的终末分化的效应细胞。
生化上的分子机制是，从甘氨酸到精氨酸的突变，可以使IgG1胞内区重要信号转导区域的酪氨酸更容易被Lyn激酶磷酸化，达成了活化阈值的降低，细胞可以更敏感地被抗原刺激而产生抗体。
这个变异体在我们人群中携带，是一个单核苷酸多态性导致的有义突变。
Q1
既然这个突变是在人群中自然存在的，因此我们想是不是可以通过携带或者是不携带这样变异体的健康人和病人队列分析，看它对于结直肠癌（CRC）发生发展的控制会产生何种不一样的效应？
基于此，我们跟北京大学人民医院申战龙教授团队合作，分析了1006例结直肠癌病人的基因型，按照标准的流调模型分成了GG型携带者、GR型携带者和RR型携带者。
同时根据1006例结直肠癌病人的10年生存曲线，观察哪一种基因型的结肠癌病人具有更长的生存期，哪一种的病人具有更短的生存期。
通过分析我们发现，如图所示红色的这条曲线，就是RR型携带的结直肠癌病人的生存曲线，显著好于其他两种基因型。
进一步的临床数据分析说明，这个变异体是独立的，且预示结直肠癌病人有更长生存期的一个相关性指标。它独立于其他的临床指标，包括性别、体重、体重指数（BMI）等等。
Q2
了解这些临床数据，我们又会问一个问题：作为控制记忆性B细胞能对抗原识别，并促进活化产生抗原受体，为什么其胞内信号转导区从甘氨酸到精氨酸（G→R）的单点突变会使得携带的病人具有对于结直肠癌更好的预后，或者是更长的生存期呢？
换句话说，hIgG1-G396R变异产生防护性角色的机制是什么？
这个显然需要我们在小鼠肿瘤模型中，进行深入的分子机制和疾病发生发展机理方面的探讨。
首先，我们得明确小鼠中到底是哪一种亚型的抗体更好地模拟了人的IgG1抗体的免疫功能。
通过左边的数据表格，大家可以看得非常清楚，我们不同亚型的IgG抗体在体内要发挥免疫效应，这在很大程度上依赖于抗体跟抗体受体的互作来实现的。
如右图所示，IgG受体是通过它的Fc恒定区跟不同免疫细胞表达的一系列Fcγ受体互作，完成对这一系列免疫细胞的功能活化调控。
右图非常清晰地展示给我们一系列的免疫细胞，包括中性粒细胞、NK细胞、树突状细胞（DC）、巨噬细胞、单核细胞、B细胞，都表达了不同类型的Fcγ受体。
左边的表格向我们展示了人的IgG1抗体跟这一系列Fcγ受体的亲和能力。在小鼠中，最接近的其实并不是小鼠的IgG1，C57BL/6背景的话是IgG2c，BALB/c背景的话是IgG2a。
因此，我们就在C57BL/6背景的IgG2c抗体的编码序列上，完成了跟人类似的G→R变异体的获取。当然了，在小鼠上是G400R，而不是G396R。
拿到这样的基因编辑小鼠以后，我们首先在小鼠皮下种植了来自小鼠结直肠癌的MC38肿瘤细胞。这个肿瘤细胞的生长速度，显然在基因修饰的小鼠得到了更慢控制，也就是长得更慢。这说明与人的数据是类似的。
但这毕竟是接种到皮下的移植癌模型，我们需要在两种不同的小鼠中诱导原发性结直肠肿瘤来更好地模拟人的结直肠癌。
我们通过在小鼠双重使用诱变剂AOM（氧化偶氮甲烷）和促炎试剂DSS（硫酸葡聚糖钠），经过几个月的诱导，可以引发小鼠的原发性结直肠癌，以此更好地模拟人的原发性结直肠癌的产生。
通过在活体小鼠展示肿瘤微环境的大小，代而指征肿瘤的生长尺寸，我们可以明显地看到：在这个时间点，基因修饰小鼠对于原发性结直肠癌也进行了良好地控制。
在实验的终点，我们把小鼠进行牺牲性地处死，检查两种小鼠的结直肠癌的数量、大小以及它离肠道末端的长度，也就是展现它的恶性程度。这也能够进一步说明，基因修饰小鼠对于肿瘤的控制是更好的。
对肿瘤部位的病理分析进一步验证了，携带精氨酸突变的基因修饰小鼠，对于控制原发性结直肠癌的确是更好。
这样的数据让我们认识到，我们可以通过这样的小鼠肿瘤模型，模拟重现携带精氨酸突变的人对于结直肠癌更好控制的临床队列数据。
Q3
下一个问题自然是，该突变为什么可以对肿瘤进行更好地控制？
因为从甘氨酸到精氨酸的突变是在IgG型B细胞抗原受体上进行的，它控制的是IgG型记忆性B细胞的抗体产生的数量和敏感度。
因此我们首先问的是，肿瘤相关抗原特异性抗体在不同基因型小鼠或者病人是不是出现差异呢？
我们拿到了RR纯合型携带病人的肿瘤切除组织样本，然后在RNA水平、蛋白水平分别揭示IgG编码mRNA或是蛋白。的确，在精氨酸纯合携带病人的结直肠癌组织是更高的。
但是这只能说明IgG1总量是高的，我们并不知道这些肿瘤微环境的IgG1是不是去识别肿瘤抗原的。为了回答这个问题，我们使用肿瘤相关抗原的蛋白芯片，把GG型或者RR型病人血清，分别运用蛋白芯片检监测它的结合能力。
在这张幻灯片，我们能够突出地看到，IgG1型B细胞识别肿瘤相关抗原抗体，在RR纯合型携带的病人是显著高的。
因为这个突变不在IgM型抗体的编码基因，所以如果以IgM作为对照，看不到明显的区别。
Q4
再一个问题就是，识别肿瘤相关抗原的特异性抗体的多寡，与其提供的针对结直肠癌保护作用之间，是不是有因果关系？
我们就需要另外一种小鼠。因为刚才向大家提到的G→R基因修饰小鼠是一个功能增强型的，相比较野生型小鼠而言，我们需要做一个功能缺失型小鼠。
基于此，我们把IgG1的整个胞内信号转导区全部切除，因为这就是一个典型的功能缺失型变异体。我们继续用卵清白蛋白（OVA）进行免疫的时候，在右下角的数表中可以非常清晰地看到，功能增强型的变异体小鼠可以产生更多的OVA特异抗体，野生型是在中间，功能缺失型小鼠产生的OVA特异抗体数量非常少。
通过使用这3种小鼠，我们继续进行肿瘤的生长观察实验。
可以非常清晰地看到，带着OVA的MC38小鼠的结直肠癌细胞的生长速度，在功能增强型的变异体小鼠是最慢的，小鼠死亡效率是最低的。也就是说，功能增强型的变异体小鼠获得了更长的生存期限。
同时我们看到：抗体的相对数量多少跟肿瘤的大小是显著性负相关，如右下角图所示；跟它的生存时间是正相关，如中间的数表所示。
这些数据让我们知道，肿瘤特异性抗体如何让小鼠或者病人获得更长的生存曲线，以及对肿瘤的控制。
Q5
抗体很有可能会对肿瘤微环境的一系列不同的免疫细胞产生影响，通过抗体的Fc端和各类免疫细胞上的各类Fc受体互作来实现。是不是这样呢？
我们重新分析了北京大学张泽民教授和申占龙教授在2020年发表的一篇Cell中，对18个结直肠癌病人肿瘤微环境的单细胞测序数据。我们发现，这18个病人中包含1个RR携带者、11个GR携带者、6个GG携带者。
基于此，我们能够做的是对RR+GR、GG携带病人，进行单细胞水平的肿瘤微环境免疫细胞类型的队列比较。
我们非常清晰地发现，在B细胞相关的单细胞分析中，部分IgG型浆细胞，就是产生IgG型（主要以IgG1为主）的免疫细胞数量得到了显著的增加。
在CD8+T细胞的单细胞分析部分，我们能发现，具有功能性杀死肿瘤细胞的各类细胞亚群，在R变异体携带病人的肿瘤微环境中得到明显提升，而耗竭型细胞亚群在R变异体携带病人大为减少。
在CD4+T细胞的单细胞分析部分，我们发现，各类正向促进肿瘤免疫的细胞亚群，的确在R变异体携带病人得到了明显提升，而负向调控免疫应答反应的Treg细胞数量减少。
综上所述，当我们看到R变异体携带病人的肿瘤微环境有更多的分泌IgG的终末分化的B细胞亚群浆细胞，更多功能性T细胞，无论是CD4还是CD8T细胞的时候，我们就想，是不是R变异体携带病人更有可能促使肿瘤微环境产生TLS（三级淋巴样结构），进而更好地控制肿瘤发生发展呢？
通过对R变异体携带病人的肿瘤微环境进行多色组织切片染色，我们的确能够非常清晰地看到三级淋巴样结构，其面积、功能和数量都明显提升。这样的话，能够帮助整个肿瘤微环境更好地控制和清除结直肠癌细胞。
Q6
最后一个问题，为什么当肿瘤微环境存在更多的肿瘤相关抗原特异性IgG1抗体的情况下，可以让整个肿瘤微环境具有促进控制和杀伤肿瘤的能力呢？
我们后续的一系列相关测试得到的提示是，肿瘤特异性抗体的存在，能够对肿瘤细胞进行吞噬的免疫细胞，包括DC细胞、巨噬细胞，可以通过抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP），更好地完成对肿瘤细胞的吞噬、对肿瘤细胞抗原的提取，呈递给我们的T细胞和B细胞。
在这展示的是巨噬细胞的数据，我们发现巨噬细胞在吞噬没有被IgG抗体包裹的肿瘤细胞，不同浓度IgG抗体包裹的肿瘤细胞的效率上，存在非常大的差异。巨噬细胞能够高效地吞噬被小鼠的IgG2c、人IgG1型肿瘤相关抗原特异性抗体包裹的肿瘤细胞。
类似的，当我们去观察DC对肿瘤细胞的吞噬的时候，用的是OT1小鼠体系，我们把肿瘤细胞表面包裹了不同浓度的IgG肿瘤相关抗原的特异性抗体。
然后让DC对这些肿瘤细胞完成吞噬，我们能够清楚地发现，当DC碰见的是IgG亚型抗体包裹的肿瘤细胞的时候，它对肿瘤细胞的内吞能力显著提升。同时，内吞后的DC对于OT1小鼠的CD8T细胞的活化也更显著提升。
通过来自巨噬细胞和树突状细胞的数据，我们认识到，在整个肿瘤微环境里，当记忆性B细胞通过表面的记忆性B细胞受体IgG-BCR，完成对肿瘤抗原免疫识别的时候，在hIgG1-G396R变异体携带者的个体中更高效地完成对肿瘤抗原的获取，降低肿瘤抗原特异性B细胞的活化阈值，使它能够更快更好地增殖分化并产生抗体。
进而，对整个肿瘤微环境的巨噬细胞、DC、NK细胞在内的免疫细胞产生更好的正面影响，在整个肿瘤微环境中能够更高效地形成三级淋巴样结构，施加对肿瘤细胞的控制。
因此，携带hIgG1-G396R变异体的结直肠癌病人，能够更高效地对结直肠癌细胞进行免疫控制，获得更好的生存时间。
在结束我今天的报告之前，让我感谢实验室完成工作的同学们，他们是杨冰、陈相军以及参与本课题的其他同学，也感谢我们的合作者，感谢经费的支持机构。
我今天的报告到此结束。
