第四章    肠道微生物组研究14个主题方向

4.13 技术方法

4.13.2 主要认知和研究现状

4.13.2.2 组学技术

除了宏基因组学外，微生物组研究的常用组学技术还包括代谢组学、宏转录组学、宏蛋白质组学、培养组学等。近年来，分析单个微生物基因组、转录组等的单细胞技术以及空间组学技术等，在研究微生物组的多样性、组成结构、动态变化和与宿主相互作用方面，成为传统宏基因组学技术的有力补充。

代谢组学

基于质谱的代谢组学是微生物组研究的关键技术之一，可检测和识别菌群产生的小分子，并了解这些菌群代谢物的功能作用。高分辨率质谱技术的发展极大地提高了代谢物检测的灵敏度、特异性和覆盖范围，特别是非靶向代谢组学方法能够系统地捕捉样本中所有可检测代谢物的变化，发现未知的代谢通路和生物标志物。^[4]

图4.13.7 微生物组研究中基于质谱的代谢组学^[4]

用于解释微生物组数据的代谢组分析流程包括数据采集、数据预处理、结构鉴定、建立数据联系和数据可视化。搜索质谱库是微生物代谢物注释的基本方法，计算机工具可改进代谢物注释、分析子结构。通过多元分析发现数据趋势，采用相关分析等方法将代谢物和微生物联系起来，随后进行基于代谢途径的分析，可以建立微生物组与代谢物的关系。^[4]

近期代表性研究

宏转录组学

宏转录组学是一种分析样本中微生物群落转录组的技术, 可以识别肠道微生物群落中的活跃微生物及基因表达，监测微生物群落在不同生理状态下的动态变化，揭示微生物与宿主相互作用的机制，识别出与疾病相关的微生物和代谢途径，为疾病的诊断、治疗提供新的生物标志物和靶点^[5]。

图4.13.8 宏转录组学工作流程^[5]

宏转录组学的流程包括样本的收集、样本保存、样本均质化、总RNA 提取、RNA 分馏、文库制备、测序、数据预处理和质量控制等步骤。该技术具有不需要培养、直接分析RNA 并揭示微生物群落的活跃成员及功能的优势。然而也存在一些局限性，如样本处理复杂、rRNA 去除效率不一致以及数据分析复杂等。^[5]

未来，宏转录组学的发展将集中在以下方面，包括采用长读测序技术、多组学数据整合分析、使用机器学习等分析方法以及新型RNA 富集和保存技术^[5]。

近期代表性研究

宏蛋白质组学

宏蛋白质组学是一种新兴的研究方法，通过分析微生物群落的蛋白质时空表达和动态变化，在揭示肠道微生物组的功能、代谢通路、生态互动及与宿主互作方面具有巨大潜力。相比宏基因组学和宏转录组学，宏蛋白质组学提供了微生物实际执行功能的直接证据，补充了前者所揭示的遗传潜力和基因表达信息。例如，对代谢综合征患者粪便的宏蛋白质组学分析，揭示出肠道炎症水平以及细菌组成和代谢的细微变化。宏蛋白质组学研究流程包括样本采集、蛋白质提取、蛋白质分离、质谱分析和数据库搜索。其中样本储存和处理是关键步骤，不同的处理方法会显著影响蛋白质的鉴定和功能分析。^[6]

培养组学

传统认为，人体内大多数微生物无法在实验室条件下培养。然而，新开发的培养技术，包括使用复杂培养基、模拟体内环境的培养条件、微流控技术及低氧或厌氧培养系统，成功扩大了可培养微生物的范围。这些技术不仅增进了对已知微生物的了解，还揭示了许多先前未培养的物种。培养组学结合了微生物培养与高通量测序技术，旨在系统性地分离并培养微生物，随后进行基因组测序和功能分析。这种方法不仅提升了对微生物多样性的认识，还促进了新基因、酶和代谢途径的发现，为生物技术和医药领域提供了丰富的资源，也使研究者能够直接研究并验证特定微生物对宿主健康的影响和机制成为可能。^[7]

图4.13.9 培养组学工作流程^[7]

近期代表性研究

聚焦：单细胞方法

用于分离、培养、分析复杂群落中单个微生物的基因组和转录组的单细胞技术，是人类微生物组研究的前沿技术，主要包括液滴微流控方法、基于微阵列（微孔板）的方法。单细胞基因组学分析不仅扩展了微生物生命树，还加深了对人类微生物组的生态和演化的认知。单细胞转录组学可揭示微生物的功能异质性，包括基于组合条形码的方法（PETRI-seq 和microSPLiT）、基于荧光原位杂交的空间转录组学（par-seqFISH）、宿主- 微生物双重转录组学技术。这些单细胞方法在微生物组研究中各有优势，能够弥补传统方法的不足，为解析微生物的复杂性、功能变异性提供了新的工具和思路。现有的宿主单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据成为挖掘隐藏微生物RNA 信息的宝库。^[8]

图4.13.10 微生物组研究中的单细胞方法^[8]

近期代表性研究

4.13.2.3 肠道芯片

为研究宿主- 微生物组互作，科学家们开发了多种体外模型。其中肠道芯片（gut-ona-chip）作为一种微流控装置，可以比传统体外模型更好地模拟真实、复杂的肠道结构和功能，通过控制流体动力学、机械变形、氧梯度和分区培养，实现人类肠道多种细胞与微生物的长期共培养^[9]。

总体上，肠道芯片平台的注射泵可控制不同培养基流动，以产生营养物质、生化分子、氧气和流体剪切应力的梯度。计算机控制的驱动系统会产生真空驱动的机械变形，模拟肠道的蠕动运动。在芯片构建的肠黏膜界面上，上皮层由干细胞、吸收细胞、杯状细胞和其他分化细胞组成，并形成黏液层，模型还可引入间质细胞、免疫细胞、肠神经细胞和内皮细胞等，从而更好地模拟肠道与微生物组的交互。持续的微流控流动模拟了肠腔和血管内的流动，提供营养物质和外源性分子，去除微生物细胞及废物，并通过施加剪切应力促进上皮细胞形成绒毛样结构。通过在肠腔微通道、血管微通道分别引入缺氧培养基和含氧培养基形成氧梯度，肠道芯片可实现厌氧和需氧微生物的共培养。（图4.13.11）

图4.13.11 肠道芯片平台示意图^[9]

这些功能特性使肠道芯片能够更加精确地模拟人类肠道的生理和病理环境，为研究宿主- 微生物组互作提供了先进的体外平台，可广泛应用于研究肠道相关的疾病，包括感染性疾病、炎症性肠病和肿瘤等，以深入了解病理生理机制，并筛选潜在的治疗药物。此外，通过整合患者衍生细胞和微生物样本，肠道芯片技术还可以开发个性化的“患者芯片”系统，推进精准医疗的发展。^[9]

近期代表性研究

4.13.2.4 合成生物学

合成生物学一门交叉学科，旨在重新设计生物系统，使之以可预测的方式执行新功能。利用合成生物学方法对微生物进行遗传工程改造，可以深入研究微生物的基因功能、代谢途径，揭示宿主- 微生物互作的机制。

在转化应用层面，合成生物学的潜在应用领域主要包括疾病的诊断和治疗。合成生物学可以用于设计能够检测肠道特定病原体或疾病标志物的生物传感器微生物，帮助实现无创的早期疾病诊断。此外，开发智能微生物药物递送系统，能够在特定的肠道环境精确释放药物，提高药物的疗效和靶向性。以CRISPR 为基础的一系列技术，也使得在肠道对微生物进行原位基因改造、实施精准的靶向性微生物组干预成为可能。而且通过工程化患者自身的肠道微生物，可以提供个性化的治疗方案，例如通过定制工程益生菌治疗特定的肠道疾病或调节免疫反应。^[10]

在技术层面，为实现对外部信号的感知并转化为特定应答，基于合成生物学的工程细菌需要具备传感输入、控制基因表达、记忆、产生和输送治疗分子、“自杀”等功能，相应的遗传“工具箱”在不断扩充。针对压力、温度、群体感应信号和其他小分子的装置，可控制治疗分子的生成和输送，基于营养缺陷型、温敏调控、毒素- 抗毒素中和作用的 “自杀”开关，可用于确保工程菌的生物安全性。^[11]

图4.13.12 工程菌的功能模块^[11]

目前工程菌的范围主要局限于少数模式菌，菌群中绝大多数微生物仍缺乏基因操作的手段，开发标准化的工程改造工具有望改造菌群中的非模式菌株。基因编辑技术的进步以及多组学数据的整合、安全性和生物容纳技术的优化，未来将进一步推进合成生物学在肠道微生物组领域的应用，助力开发出更加有效、安全的治疗策略。

近期代表性研究

4.13.2.5 机器学习

机器学习对微生物组研究的重要性与日俱增，它通过识别复杂数据的模式和关系，提供了强大的分析工具，将微生物组特征与复杂的宿主表型和疾病联系起来。基础、临床研究经常使用的机器学习工具主要包括分类、回归、聚类、降维等^[12]。

图4.13.13 机器学习应用于微生物学研究的工作流程^[12]

机器学习的方法主要包括监督学习和无监督学习。监督学习通过分类、回归模型对已知结果进行预测和分析，例如朴素贝叶斯和随机森林模型用于微生物的分类，而线性回归和随机森林回归模型用于预测连续数值。特征选择和提取方法（如LASSO、随机森林）能够从大量特征中筛选出重要特征，提高模型的解释性和预测性能。

无监督学习方法主要用于发现数据中的未知结构。聚类算法如k均值和层次聚类，可以将样本分组，从中识别出不同的菌群类型。主成分分析（PCA）、t-SNE和UMAP等降维技术，则通过将高维数据简化为低维表示，便于数据可视化和探索性分析。在模型选择和评估方面，交叉验证和独立验证集被广泛应用，以确保模型的泛化能力和可靠性。留一法（LODO）可以测试模型在不同数据集的表现，进一步验证其适用性。

尽管机器学习在肠道微生物组研究中展示了强大的分析能力，但数据质量、批次效应等问题仍需关注。通过批次效应校正和标准化，结合高质量的数据，可以提高模型预测的准确性，确保研究结果的可靠性。总体而言，机器学习为肠道微生物组研究提供了重要的方法和工具，推动了对微生物组与宿主健康关系的深入理解。

近期代表性研究

参考文献

4.Bauermeister, A., et al., Mass spectrometry-based metabolomics in microbiome investigations. Nat Rev Microbiol, 2022. 20(3): p. 143-160.

5.Ojala, T., et al., Current concepts, advances, and challenges in deciphering the human microbiota with metatranscriptomics. Trends Genet, 2023. 39(9): p. 686-702.

6.Van Den Bossche, T., et al., The Metaproteomics Initiative: a coordinated approach for propelling the functional characterization of microbiomes. Microbiome, 2021.9(1): p. 243.

7.Lagier, J.C., et al., Culturing the human microbiota and culturomics. Nat Rev Microbiol, 2018. 16: p. 540-550.

8.Lloréns-Rico, V., et al., Single-cell approaches in human microbiome research. Cell,2022. 185(15): p. 2725-2738.

9.Shin, Y.C., et al., Modelling host–microbiome interactions in organ-on-a-chipplatforms. Nature Reviews Bioengineering volume, 2024. 2 pag: p. 175–191

10.McNerney, M.P., et al., Theranostic cells: emerging clinical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet, 2021. 22(11): p. 730-746.

11.Pedrolli, D.B., et al., Engineering Microbial Living Therapeutics: The Synthetic Biology Toolbox. Trends Biotechnol, 2019. 37(1): p. 100-115.

12.Asnicar, F., et al., Machine learning for microbiologists. Nat Rev Microbiol, 2024.22(4): p. 191-205.