第四章    肠道微生物组研究14个主题方向

4.13 技术方法

“技术方法”主题主要关注研究者对肠道微生物组研究中的主流和新兴技术方法，包括组学技术、器官芯片、合成生物学、机器学习等。我们将简要概述该主题目前的主要认知、焦点和未来方向。

4.13.1 高影响力研究者

“技术方法”主题的高影响力研究论文的作者姓名词云和核心研究团队（以通讯作者为准）及代表性研究，分别详见图4.13.1、表4.13.1

图4.13.1 “技术方法”主题的作者姓名词云

表4.13.1 “技术方法”主题的代表性研究者

4.13.2.1 微生物组研究分析流程

由Rob Knight 领衔在Nature Reviews Microbiology发表的重磅综述Best ractices for analysing microbiomes，讨论了进行微生物组研究的最佳实践方法，系统性地介绍了菌群研究的实验设计、方法选择和数据分析方式，在列举和比较大量研究方法的同时指出了目前OTU分析、菌群丰度分析和相关性分析的缺陷，强调数据共享、方法标准化的重要性，为研究者提供了进行高质量微生物组研究的详细路线图^[1]。

设计微生物组实验时需要考虑多种因素，包括：①控制混杂因素，如年龄、性别、饮食、生活方式，有助于揭示研究组和对照组的微生物组差异；②采用纵向采样，不仅有助于控制混杂因素，还可评估微生物组稳定性；③ 技术因素和样本处理流程必须标准化，减少由试剂、引物和样本保存等因素引入的变异；④ 动物研究还应额外考虑笼效应和食粪性等因素（图4.13.3）。

图4.13.3 微生物组实验设计的考量因素^[1]

研究微生物组的常用测序方法包括16S rRNA 测序（标记基因/ 扩增子测序）、宏基因组学测序和宏转录组学测序。

图4.13.4 16SrRNA、宏基因组和宏转录组测序工作流程^[1]

16S rRNA 测序利用特定引物扩增16S rRNA 基因的可变区， 提供快速、低成本的微生物群落概览，适用于低生物量和宿主污染样本。分析流程包括去噪（如使用Deblur或DADA2）、物种分类注释（ 如RDP分类器）、功能预测分析（ 如PICRUSt）。

宏基因组学测序，也称鸟枪法测序，是指对测序样本中所有微生物基因组进行测序，从而提供物种、菌株级别的详细分类信息及功能基因的检测方法。尽管测序成本较高，样本准备和分析流程复杂，但宏基因组学能够捕捉所有存在的DNA，包括病毒和真核生物DNA，提供更详细的基因组信息。分析流程包括去除宿主DNA、基于读段（read）的分析（如Kraken、MEGAN、HUMAnN2）或基于组装的分析（如 metaSPAdes、MEGAHIT）。

宏转录组学测序通过测序样本的RNA 提供微生物基因表达和活性功能输出的信息，从而更好地了解微生物群落的功能活动。分析流程包括去除rRNA、宿主RNA，而后进行基于读段或组装的分析。

基于以上三种方法的基本分析后还需完成高级分析，如α 多样性、β 多样性、物种组成、机器学习等，可进一步挖掘微生物组的变异模式。

整合多组学数据是全面理解微生物群落功能的关键，整合不同数据类型，包括标记基因测序、宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学和代谢组学，能够提供更全面的生物系统图景。例如，整合宏基因组学、宏转录组学和代谢组学数据可以揭示微生物群落的基因调控及与代谢物的关联，提供超越单一组学研究的见解。

图4.13.5 整合组学数据与微生物组数据的分析方法^[1]

聚焦：长读长测序（三代测序）

作为先进的基因组测序方法，长读长测序技术已开始在微生物组研究中发挥重要作用。PacBio、ONT（纳米孔）是长读长测序领域的两大主要公司。

长读长测序技术可以显著提高微生物组分析的精度和深度。在宏基因组组装方面，长读长测序能够生成更完整、更连续的宏基因组组装（MAGs），包括质粒、移动遗传元件，这对研究微生物基因组的复杂性和功能具有重要意义。长读长测序技术还能够在物种、菌株水平进行更准确的分类和群落结构分析，改善微生物组多样性研究。此外，长读长测序能够更准确地检测和分析微生物的基因转移事件，检测大型结构变异（如重复、倒位、插入和缺失）， 以及识别DNA 或RNA的甲基化模式。^[2]

图4.13.6 短读长和长读长测序在宏基因组学研究的应用差异^[2]

然而长读长测序技术在成本、DNA 样本需求量和误差率方面面临一些挑战，相信随着技术进步和成本降低，它将帮助研究者更全面、细致地探索微生物群落的结构、功能和进化关系^[2]。

近期代表性研究

聚焦：采样方法

对肠道菌群的研究离不开标准化的采样方法，目前主要采用粪便、肠黏膜活检、肠液等作为研究样本，但都存在一些缺陷，不能完整反映肠道菌群的组成。测序技术可以帮助研究者理解宿主体内的肠道菌群，但不同的采样方法可能会使研究结果出现偏差。目前已有的采样技术包括粪便采样、内镜采样（活检采样、管腔刷采样、激光捕获显微切割采样）、抽吸肠液采样、手术采样等，均存在限制及不足。新型可吞咽胶囊式采样装置，可以无创、准确地得到此前无法通过内窥镜、粪便样本获取的人体肠道微生物组和代谢组信息，助力人类肠道多组学分析。^[3]

近期代表性研究

参考文献

1.Knight, R., et al., Best practices for analysing microbiomes. Nat Rev Microbiol, 2018.16(7): p. 410-422.

2.Agustinho, D.P., et al., Unveiling microbial diversity: harnessing long-read sequencing technology. Nat Methods, 2024.

3.Tang, Q., et al., Current Sampling Methods for Gut Microbiota: A Call for More Precise Devices. Front Cell Infect Microbiol, 2020. 10: p. 151.